Projekte Experimentelle Virologie

Projekte Experimentelle Virologie

Prinzipien der Assemblierung und des Zelleintritts von HCV und deren Rolle in der Viruspersistenz

Fünfzig bis 90 Prozent aller HCV-Infektionen verlaufen chronisch. Die Verbindung von Viren mit Lipoproteinen trägt durch einen direkten Einfluss auf den Viruseintritt in die Leberzelle und außerdem durch den Schutz vor neutralisierenden Antikörpern zur Persistenz bei. Wir untersuchen Wirtsfaktoren und virale Faktoren, die die Assoziation des Virus mit Lipoproteinen beeinflussen, um ihre Rolle für die Viruspersistenz zu klären. Die Interaktion von HCV mit Lipoproteinen beginnt während der Virusassemblierung. Diese findet in den sogenannten Lipid Droplets statt, zellulären Organellen, die Lipide einlagern (Abbildung 1: Vieyres et al. PLoS Pathogens 2016). HCV nutzt zelluläre Lipasen wie etwa ATGL, um Lipide für die Bildung von HCV Lipoviropartikeln zu mobilisieren (Vieyres et al. PLoS Pathogens 2020). 

Nach der Freisetzung von HCV-Partikeln werden zirkulierende Lipoproteine in diese Partikeln eingebaut (Bankwitz et al. J Hepatol 2017). Dieser Reifungsprozess begünstigt sowohl die Anheftung des Virus an Leberzellen als auch den Schutz von Antikörpern (Abbildung 2 und Bankwitz et al. J Hepatol 2017). Unterstützt durch den SFB900 untersuchen wir die zellulären und viralen Proteine, die die Wechselwirkung zwischen HCV und Lipoproteinen vermitteln. Letztendlich sollen die so gewonnenen Erkenntnisse darüber, wie HCV mit Hilfe der Lipoproteine der Antikörperantwort entkommt, in die Entwicklung eines Impfstoffes gegen HCV einfließen. 

 

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Determinanten der protektiven Immunität gegen HCV: Goldstandard für die Vakzinentwicklung

Bei einer geringen Zahl aller HCV-Patienten führen starke Immunantworten zur Kontrolle und schließlich Elimination der Virusinfektion. Allerdings sind die Eigenschaften dieses natürlichen Immunschutzes nicht genau verstanden. Vor allem ist die Rolle von Antikörpern für den Schutz von HCV nicht klar definiert. Daher untersuchen wir, unterstützt durch das DZIF HCV-Vakzin-Projekt, wie Antikörper vor einer HCV-Infektion schützen. Welche Eigenschaften haben die Antikörper, die bei einer ausheilenden HCV-Infektion entstehen? Wie unterscheiden sich diese Antikörpern von denen, die gebildet werden, wenn die Infektion chronisch wird? Werden unterschiedliche Bereiche der viralen Hüllproteine attakiert? Welche Faktoren beeinflussen die Bildung besonders guter Antikörper und wie gut sind die Antikörper, die Vakzinekandidaten induziern? Diesen Fragen gehen wir nach, um einen Impfstoff zu entwickeln, der besonders gut schützende Antikörper induziert.

Um einen präzisen Maßstab für schützende Immunität zu entwickeln, haben wir zunächst Antikörper aus dem Blut von 104 HCV-positiven Patienten isoliert und anschließend hinsichtlich ihrer neutralisierenden Eigenschaften gegen möglichst vielen verschiedenen HCV-Varianten untersucht. Mit Hilfe von bioinformatischen Methoden haben wir gelernt, dass Varianten unabhängig von ihrem genetischen Hintergrund unterschiedlich auf Antikörper reagieren. Unsere Ergebnisse können dazu beitragen in Zukunft einen breit wirksamen Impfstoff zu entwickeln sowie die Wirksamkeit von Impfstoffkandidaten einzuschätzen. 

Tour to HCV neutralization space. Final stop: B-cell vaccine | Nature Portfolio Webcasts

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Mechanismen des HCV-Gewebe- und Speziestropismus

HCV hat einen engen Speziestropismus und infiziert natürlicherweise nur den Menschen. Welche Faktoren dies bewirken ist noch nicht vollständig geklärt. Dass deshalb keine immunkompetenten Kleintiermodelle für HCV existieren ist ein großes Hindernis für die Impfstoffentwicklung, da eine Priorisierung von Impfstoffkandidaten im Vorfeld der kostspieligen klinischen Entwicklung dadurch verhindert wird. Die Unfähigkeit von HCV sich in nicht-menschlichen Zellen zu vermehren könnte am Fehlen oder Inkompatibilität von essentiellen Ko-Faktoren für die Virusreplikation und/oder an antiviralen Restriktionsmechanismen in nicht-menschlichen Zellen liegen, die eine Replikation des Virus effektiv verhindern. Unter diesen Annahmen wenden wir verschiedene genetische Screening-Systeme an, um ein umfassendes Profil aller relevanten Faktoren für die Speziesbarriere der HCV-Infektion in Mauszellen zu erstellen. Mit Hilfe dieser Informationen wollen wir in vivo-Modelle für HCV-Impfstoffforschung entwickeln. Dieses Projekt wurde durch einen ERC Starting Grant finanziert (VIRAFRONT, 2012-2017) und wird nun mit Unterstützung des Deutschen Zentrums für Infektionsforschung (DZIF) und einer Förderung des National Institutes of Health (NIH, USA) weitergeführt. Mit Hilfe eines genomweiten cDNA-Screens haben wir zwei neue murine Restriktionsfaktoren identifiziert, welche die HCV-Infektion von murinen Leberzellen unterdrücken. Das Lektin Cd302 und der Komplementrezeptor Cr1l kooperieren miteinander, stören den Zelleintritt von HCV und lösen transkriptionelle Veränderungen aus, die die HCV-Infektion blockieren (Brown et al. 2020). Der „knock out“ von Cd302 steigert die Empfänglichkeit von HCV-Rezeptortransgene Tieren für die HCV-Infektion. Diese Ergebnisse zeigen eine neue Facette der leberintrinsischen Immunität und weisen neue Wege für die Entwicklung von Tiermodellen zur Qualifizierzung von HCV-Impfstoffen.  

 

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Antivirale Wirkstoffe gegen HCV, RSV und Coronavirus

Wir entwickeln und nutzen Hochdurchsatz-Screeningassays, um Moleküle mit antiviraler Aktivität gegen, RSV und SARS-CoV-2 zu identifizieren. Dafür setzen wir Lumineszenz- oder Reporter-basierte Systeme ein und nutzen Substanzbibliotheken des HZI, der MHH sowie weiterer externer Kooperationspartnern ein. Beispielsweise Kooperieren wir mit dem Scripps Institute und verwenden die ReFRAME repurposing Substanzbibliothek. ReFRAME ist die weltweit größte Sammlung von bereits zugelassenen bzw. klinisch erprobten Wirkstoffen. Die von uns verwendeten Sammlungen umfassen ein großes Spektrum chemischer Grundstrukturen und komplexer Molekülee aus natürlichen Quellen (Sekundärstoffe aus Bakterien, Pilzen oder Pflanzen) sowie bereits zugelassenen Medikamenten. Unsere Expertise in virologischer Grundlagenforschung ermöglicht uns, die Wirkweisen dieser Substanzen und virale Resistenzmechanismen zu ergründen. Dabei verfolgen wir das Ziel, neue Therapieoptionen zu entwickeln. 

In Zusammenarbeit mit Experten am HZI haben wir die Wirkweise von Labyrinthopeptinen gegen unterschiedliche Viren analysiert. Labyrinthopeptine binden bestimmte Lipide und führen zur Zerstörung der Membranen von Viren. Dies macht sie zu sehr breit antivirale wirkenden Molekülen, gegen die Viren nur schwer eine Resitenz entwickeln können (Blockus et al. 2020).
Gefördert durch das Helmholtz International Laboratory for anti-infectives haben wir im Kontext eines internationalen Konsortiums ein neues Wirkprinzip für die Behandlung der RSV-Infektion aufgedeckt. RSV konzentriert seine Komponenten für die RNA-Vermehrung in sogenannten „inculsion bodies“. Diesen flüssigen Organellen kommt eine entscheidende Bedeutung für die Genomreplikation und die virale Transkription zu. Der neue Wirkstoff verhärtet diese Replikationsorganelle des Virus und stört auf diese Weise die Infektion (Risso-Ballester et al. Nature 2021). 
 

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Wirts- und Virusfaktoren, die die Empfänglichkeit für HCV und RSV kontrollieren

In einigen Patienten heilt die HCV-Infektion auf natürlichem Wege aus, in der Mehrzahl der Fälle wird sie jedoch chronisch. Darüber hinaus unterscheidet sich der Verlauf der chronischen Infektion zwischen Patienten. Eine Infektion mit RSV haben die meisten Kinder in den ersten 18 Monaten ihres Lebens durchgemacht. Ein Bruchteil dieser Kinder leidet unter einem schweren Verlauf der Infektion. Für beide Erkrankungen sind die Prinzipien, die der Empfänglichkeit und der Schwere der Infektion zugrunde liegen, nur unvollständig aufgeklärt. Diese Informationen sind allerdings von entscheidender Bedeutung, um eine optimale Vorsorge und medizinische Versorgung zu gewährleisten. Aus diesem Grund erforschen wir gemeinsam mit unseren klinischen Partnern an der MHH die Prinzipien der Empfänglichkeit des Wirtes für diese viralen Infektionen. Dabei nutzen wir Next Generation Sequencing-Technologien, um Eigenschaften von Wirt und Erreger zu untersuchen und zu bestimmen, welche Rolle die Wirtsgenetik für die Empfänglichkeit für die Infektion spielt. Durch Zusammenarbeit mit klinischen Forschern haben wir Zugang zu einzigartigen Patientenkohorten, die es uns gestatten, die Viruspathogenese im Menschen zu studieren. Dieses Projekt wird vom RESIST Exzellenzcluster und dem INDIRA-Netzwerk finanziert.

 

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Prinzipien der Assemblierung und des Zelleintritts von HCV und deren Rolle in der Viruspersistenz

Vieyres G, Reichert I, Carpentier A, Vondran FWR, Pietschmann T. The ATGL lipase cooperates with ABHD5 to mobilize lipids for hepatitis C virus assembly. PLoS Pathog. 2020 Jun 15;16(6):e1008554. doi: 10.1371/journal.ppat.1008554. PMID: 32542055; PMCID: PMC7316345.

Bankwitz D, Doepke M, Hueging K, Weller R, Bruening J, Behrendt P, Lee JY, Vondran FWR, Manns MP, Bartenschlager R, Pietschmann T. Maturation of secreted HCV particles by incorporation of secreted ApoE protects from antibodies by enhancing infectivity. J Hepatol. 2017 Apr 22. pii: S0168-8278(17)30251-9.

Vieyres G, Welsch K, Gerold G, Gentzsch J, Kahl S, Vondran FW, Kaderali L, Pietschmann T. ABHD5/CGI-58, the Chanarin-Dorfman Syndrome Protein, Mobilises Lipid Stores for Hepatitis C Virus Production. PLoS Pathog. 2016 Apr 28;12(4):e1005568.

Gerold G, Meissner F, Bruening J, Welsch K, Perin PM, Baumert TF, Vondran FW, Kaderali L, Marcotrigiano J, Khan AG, Mann M, Rice CM, Pietschmann T. Quantitative Proteomics Identifies Serum Response Factor Binding Protein 1 as a Host Factor for Hepatitis C Virus Entry. Cell Rep. 2015 Aug 4;12(5):864-78.

Hueging K, Doepke M, Vieyres G, Bankwitz D, Frentzen A, Doerrbecker J, Gumz F, Haid S, Wölk B, Kaderali L, Pietschmann T. Apolipoprotein E codetermines tissue tropism of hepatitis C virus and is crucial for viral cell-to-cell transmission by contributing to a postenvelopment step of assembly. J Virol. 2014 Feb;88(3):1433-46.

Gentzsch J, Brohm C, Steinmann E, Friesland M, Menzel N, Vieyres G, Perin PM, Frentzen A, Kaderali L, Pietschmann T. hepatitis c Virus p7 is critical for capsid assembly and envelopment. PLoS Pathog. 2013;9(5):e1003355.

 

Determinanten der protektiven Immunität gegen HCV: Goldstandard für die Vakzinentwicklung


Bankwitz, D., Bahai, A., Labuhn, M., Doepke, M., Ginkel, C., Khera, T., Todt, D., Ströh, L. J., Dold, L., Klein, F., Klawonn, F., Krey, T., Behrendt, P., Cornberg, M., McHardy, A. C., & Pietschmann, T. (2020). Hepatitis C reference viruses highlight potent antibody responses and diverse viral functional interactions with neutralising antibodies. Gut, gutjnl-2020-321190. Advance online publication. https://doi.org/10.1136/gutjnl-2020-321190

Bartenschlager R, Baumert TF, Bukh J, Houghton M, Lemon SM, Lindenbach BD, Lohmann V, Moradpour D, Pietschmann T, Rice CM, Thimme R, Wakita T (2018) Critical challenges and emerging opportunities in hepatitis C virus research in an era of potent antiviral therapy: considerations for scientists and funding agencies. Virus Res. 248: 53-62.

Vasiliauskaite I, Owsianka A, England P, Khan AG, Cole S, Bankwitz D, Foung SKH, Pietschmann T, Marcotrigiano J, Rey FA, Patel AH, Krey T (2017) Conformational Flexibility in the Immunoglobulin-Like Domain of the Hepatitis C Virus Glycoprotein E2. MBio 8(3)..

Bankwitz D, Doepke M, Hueging K, Weller R, Bruening J, Behrendt P, Lee JY, Vondran FWR, Manns MP, Bartenschlager R, Pietschmann T (2017) Maturation of secreted HCV particles by incorporation of secreted apoE protects from antibodies by enhancing infectivity. J Hepatol 67(3): 480-489. Bankwitz D, Pietschmann T (2016) Hepatitis C virus plays hide and seek with neutralizing antibodies. Hepatology 64(6): 1840-1842.

Doerrbecker J, Friesland M, Riebesehl N, Ginkel C, Behrendt P, Brown RJ, Ciesek S, Wedemeyer H, Sarrazin C, Kaderali L, Pietschmann T, Steinmann E (2014) Incorporation of primary patient-derived glycoproteins into authentic infectious hepatitis C virus particles. Hepatology 60(2): 508-520. 

 

Mechanismen des HCV-Gewebe- und Speziestropismus

Repressors of viral infection, WO2017/207725A1

Brown RJP, Tegtmeyer B, Sheldon J, Khera T, Anggakusuma, Todt D, Vieyres G, Weller R, Joecks S, Zhang Y, Sake S, Bankwitz D, Welsch K, Ginkel C, Engelmann M, Gerold G, Steinmann E, Yuan Q, Ott M, Vondran FWR, Krey T, Ströh LJ, Miskey C, Ivics Z, Herder V, Baumgärtner W, Lauber C, Seifert M, Tarr AW, McClure CP, Randall G, Baktash Y, Ploss A, Thi VLD, Michailidis E, Saeed M, Verhoye L, Meuleman P, Goedecke N, Wirth D, Rice CM, Pietschmann T. Liver-expressed Cd302 and Cr1l limit hepatitis C virus cross-species transmission to mice. Sci Adv. 2020 Nov 4;6(45):eabd3233

von Schaewen M, Dorner M, Hueging K, Foquet L, Gerges S, Hrebikova G, Heller B, Bitzegeio J, Doerrbecker J, Horwitz JA, Gerold G, Suerbaum S, Rice CM, Meuleman P, Pietschmann T, Ploss A (2016) Expanding the Host Range of Hepatitis C Virus through Viral Adaptation. MBio 7(6)

Anggakusuma, Brown RJ, Banda DH, Todt D, Vieyres G, Steinmann E, Pietschmann T (2016) Hepacivirus NS3/4A Proteases Interfere with MAVS Signaling in both Their Cognate Animal Hosts and Humans: Implications for Zoonotic Transmission. J Virol 90(23): 10670-10681. 

Frentzen A, Anggakusuma, Gurlevik E, Hueging K, Knocke S, Ginkel C, Brown RJ, Heim M, Dill MT, Kroger A, Kalinke U, Kaderali L, Kuehnel F, Pietschmann T (2014) Cell entry, efficient RNA replication, and production of infectious hepatitis C virus progeny in mouse liver-derived cells. Hepatology 59(1): 78-88. 

Frentzen A, Huging K, Bitzegeio J, Friesland M, Haid S, Gentzsch J, Hoffmann M, Lindemann D, Zimmer G, Zielecki F, Weber F, Steinmann E, Pietschmann T (2011) Completion of hepatitis C virus replication cycle in heterokaryons excludes dominant restrictions in human non-liver and mouse liver cell lines. PLoS Pathog 7(4): e1002029.

 

Antivirale Wirkstoffe gegen HCV, RSV und Coronavirus

Labyrinthopeptins as anti-viral agents EPA16809653.5, pending

Diagnostics and therapy for human respiratory syncytial virus (hRSV) EP17195522.2, pending

Risso-Ballester, J., Galloux, M., Cao, J., Le Goffic, R., Hontonnou, F., Jobart-Malfait, A., Desquesnes, A., Sake, S. M., Haid, S., Du, M., Zhang, X., Zhang, H., Wang, Z., Rincheval, V., Zhang, Y., Pietschmann, T., Eléouët, J. F., Rameix-Welti, M. A., & Altmeyer, R. (2021). A condensate-hardening drug blocks RSV replication in vivo. Nature, 595(7868), 596–599. https://doi.org/10.1038/s41586-021-03703-z

Blockus S, Sake SM, Wetzke M, Grethe C, Graalmann T, Pils M, Le Goffic R, Galloux M, Prochnow H, Rox K, Huttel S, Rupcic Z, Wiegmann B, Dijkman R, Rameix-Welti MA, Eleouet JF, Duprex WP, Thiel V, Hansen G, Bronstrup M, Haid S, Pietschmann T (2020) Labyrinthopeptins as virolytic inhibitors of respiratory syncytial virus cell entry. Antiviral Res 177: 104774.

Behrendt P, Perin P, Menzel N, Banda D, Pfaender S, Alves MP, Thiel V, Meulemann P, Colpitts CC, Schang LM, Vondran FWR, Anggakusuma, Manns MP, Steinmann E, Pietschmann T (2017) Pentagalloylglucose, a highly bioavailable polyphenolic compound present in Cortex moutan, efficiently blocks hepatitis C virus entry. Antiviral Res 147: 19-28

Pietschmann T (2017) Clinically Approved Ion Channel Inhibitors Close Gates for Hepatitis C Virus and Open Doors for Drug Repurposing in Infectious Viral Diseases. J Virol 91(2)
Perin PM, Haid S, Brown RJ, Doerrbecker J, Schulze K, Zeilinger C, von Schaewen M, Heller B, Vercauteren K, Luxenburger E, Baktash YM, Vondran FW, Speerstra S, Awadh A, Mukhtarov F, Schang LM, Kirschning A, Muller R, Guzman CA, Kaderali L, Randall G, Meuleman P, Ploss A, Pietschmann T (2016) Flunarizine prevents hepatitis C virus membrane fusion in a genotype-dependent manner by targeting the potential fusion peptide within E1. Hepatology 63(1): 49-62. 

Haid S, Grethe C, Bankwitz D, Grunwald T, Pietschmann T (2015) Identification of a Human Respiratory Syncytial Virus Cell Entry Inhibitor by Using a Novel Lentiviral Pseudotype System. J Virol 90(6): 3065-3073. 
Koutsoudakis G, Romero-Brey I, Berger C, Perez-Vilaro G, Monteiro Perin P, Vondran FW, Kalesse M, Harmrolfs K, Muller R, Martinez JP, Pietschmann T, Bartenschlager R, Bronstrup M, Meyerhans A, Diez J (2015) Soraphen A: A broad-spectrum antiviral natural product with potent anti-hepatitis C virus activity. J Hepatol 63(4): 813-821. 

Wirts- und Virusfaktoren, die die Empfänglichkeit für HCV und RSV kontrollieren

Diagnostics and therapy for human respiratory syncytial virus (hRSV) EP17195522.2, pending

Carpentier A, Sheldon J, Vondran FWR, Brown RJ, Pietschmann T (2020) Efficient acute and chronic infection of stem cell-derived hepatocytes by hepatitis C virus. Gut 69(9): 1659-1666.

Baier C, Haid S, Beilken A, Behnert A, Wetzke M, Brown RJP, Schmitt C, Ebadi E, Hansen G, Schulz TF, Pietschmann T, Bange FC (2018) Molecular characteristics and successful management of a respiratory syncytial virus outbreak among pediatric patients with hemato-oncological disease. Antimicrob Resist Infect Control 7: 21.

Weller R, Hueging K, Brown RJP, Todt D, Joecks S, Vondran FWR, Pietschmann T (2017) Hepatitis C virus strain-dependent usage of apolipoprotein E modulates assembly efficiency and specific infectivity of secreted virions. J Virol. pii: JVI.00422-17.

Vieyres G, Welsch K, Gerold G, Gentzsch J, Kahl S, Vondran FW, Kaderali L, Pietschmann T (2016) ABHD5/CGI-58, the Chanarin-Dorfman Syndrome Protein, Mobilises Lipid Stores for Hepatitis C Virus Production. PLoS Pathog 12(4): e1005568. 

Haid S, Grethe C, Dill MT, Heim M, Kaderali L, Pietschmann T (2014) Isolate-dependent use of claudins for cell entry by hepatitis C virus. Hepatology 59(1): 24-34.