Projekte Virale Proteomik

Charakterisierung von CD81 Rezeptor-Interaktionen bei der Hepatozyten Invasion von Hepatitis C Virus und Plasmodium

Lokalisierung von SRFBP1 in humanen Hepatomzellen. SRFBP1 ist ein HCV Eintrittsfaktor, welcher mittels quantitativer Proteomik identifiziert wurde.

Hepatitis C Virus (HCV) und der Malaria Erreger Plasmodium falciparum nutzen beide das humane Transmembranprotein CD81, um Leberzellen zu infizieren. Dies ist bemerkenswert, da sich beide Pathogene hinsichtlich ihres molekularen Aufbaus, ihrer Übertragung und den von ihnen ausgelösten Krankheiten stark unterscheiden. Eine Gemeinsamkeit ist lediglich der enge Wirtstropismus, aufgrund dessen beide Erreger unter natürlichen Umständen nur Menschen infizieren. CD81 ist einer von mehreren Faktoren, die diesen Wirtstropismus festlegen. Wie CD81 den Eintritt von HCV und  Plasmodium in die Wirtszelle ermöglicht, ist unzureichend geklärt. Es wird, aufgrund fehlender Signaldomänen im CD81 Protein, angenommen, dass CD81 die Aufnahme von HCV und Plasmodium über Protein-Protein Interaktionen (PPI) mit Membran-nahen Signalmolekülen und Zytoskelettregulatoren initiiert.

In unserer bisherigen Forschung gelang es uns, 33 CD81 PPI in humanen Hepatomzellen zu identifizieren, wobei mindestens zehn von diesen CD81 Interaktionspartnern von HCV und Plasmodium benötigt werden, um Zielzellen erfolgreich zu infizieren.  Zu diesen Proteinen gehören der Epidermale Wachstumsfaktor Rezeptor (EGFR), eine Rezeptor-Tyrosinkinase, welche in Zusammenhang mit HCV Eintritt beschrieben ist, eine Ubiquitin-Ligase und eine Endopeptidase. Unser Ziel ist es, die molekularen Funktionen dieser Wirtsfaktoren umfänglich zu untersuchen. Mit verschiedenen Domänenmutationen in den Wirtsfaktoren versuchen wir aufzuklären, wie diese Proteine den Eintritt des Erregers ermöglichen. Gleichzeitig analysieren wir die Spezifität der gefunden Interaktionen. Dazu führen wir Infektionsstudien mit anderen umhüllten Viren, mit verschiedenen HCV Genotypen sowie mit humanen als auch Nager Plasmodium Spezies in CRISPR/Cas9 Knockout-Zelllinien für den jeweiligen Eintrittsfaktor durch. Zuletzt untersuchen wir, ob die Wirtsfaktoren zu dem engen Wirts-und Gewebetropismus von HCV und Plasmodium falciparum Sporozoiten beitragen. Diese Arbeit wird Gemeinsamkeiten und Unterschiede während des Eintrittes in Hepatozyten von zwei wichtigen humanen Erregern aufdecken und stellt eine erfolgsversprechende Strategie dar, um dringend benötigte Arzneimitteltargets im Kampf gegen Malaria aufzudecken.

Kooperationspartner: Olivier Silvie (INSERM, Paris, Frankreich), Felix Meissner (Max-Planck-Institut für Biochemie, Martinsried), Lars Kaderali (Universität Greifswald)

Publikationen

Identifizierung von Eintrittsfaktoren umhüllter Viren

Quantitative Proteomanalysen zum Studium von Virus-Wirtszell Interaktionen beim Zelleintritt.

Massenspektrometrie-basierte Interaktionsproteomik hat in den vergangenen Jahren stark an Sensitivität gewonnen und kann mittlerweile quantitative Daten liefern. Mittels neuester Proteomicstechniken identifizieren und untersuchen wir Zelloberflächenmoleküle, die von Alphaviren und humanem Norovirus gebunden werden. Hierbei kombinieren wir speziell entwickelte Anreicherungsmethoden für Proteinkomplexe mit massenspektrometrischen Analysen. Dies erlaubt es uns einerseits, das Interaktom bekannter Eintrittsfaktoren wie des Tetraspanin-9 und TIM-1 mittels markierungsfreier Analyse zu bestimmen (‚label free quantification’, LFQ). Andererseits nutzen wir stabile Isotopenmarkierung von Aminosäuren in Zellkultur sowie gerichtete Crosslinking Methoden, um solche Proteine zu identifizieren, die mit viralen Hüllporteinen und Rezeptoren beim Zelleintritt interagieren (‚stable isotope labeling with amino acids in cell culture’, SILAC). Mittels CRISPR/Cas9 Editing, RNA Interferenz und Blockierungsstrategien untersuchen wir in Folgeexperimenten die identifizierten Eintrittsfaktoren.

Unser Hauptaugenmerk liegt derzeit auf humanpathogenen und Moskito übertragbaren Alphaviren sowie auf Norovirus. Identifizierte Eintrittsfaktoren und Rezeptoren testen wir anschließend auf ihre Spezifität für verwandte Viren und ihre Expression in verschiedenen humanen Geweben. Zuletzt untersuchen wir, ob verwandte Proteine in Moskitos und Primaten, d.h. im Überträgerwirt und im Reservoirwirt, ebenfalls als Eintrittsfaktoren für Chikungunyavirus fungieren. In Kooperation mit Niklas Arnberg (Umea University) und Lennart Svensson (Linköping University) führen wir funktionelle Experimente zum Norovirus Eintritt durch. Diese Arbeiten werden beleuchten, wie Alphaviren und Norovirus Wirtszellen penetrieren und können damit zur Entwicklung antiviraler Strategien beitragen.

Kooperationspartner: Margaret Kielian (Albert Einstein College, New York, NY, USA), Christine Goffinet (TWINCORE, Hannover), Pierre-Yves Lozach (Universitätsklinikum Heidelberg), Charles M. Rice (Rockefeller University, New York, NY, USA, Niklas Arnberg (Umea University, Sweden), Lennart Svensson (Linköping University, Sweden)

Publikationen

HCV – Arenavirus Koinfektion und Modulation von angeborenen Immunmechanismen

Angeborene Immunantwort bei HCV Infektion und virale Ausweichmechanismen vermittelt durch die NS3/4A Protease. (Modifiziert von Weigel, Bruening, Gerold, Journal of Immunology Research, 2016)

HCV ist ein kleines, umhülltes RNA Virus und der Erreger der Hepatitis C. Das Virus verursacht chronische Infektionen in 71 Millionen Menschen weltweit und kann schwere Leberschäden auslösen, darunter Zirrhose, Fibrose und Leberkrebs. In vielen Ländern wird eine HCV Infektion nicht diagnostiziert und es ist davon auszugehen, dass in Westafrika eine hohe Prävalenz zu finden ist. In diesen Regionen kommt es auch zu Ausbrüchen hämorrhagischer Fieberviren, wie des Lassavirus. Da eine chronische Hepatits C Infektion den Immunstatus der Leber verändert, untersuchen wir in Zellkulturmodellen, wie sie sich auf eine sekundäre Infektion mit Arenaviren auswirkt. Insbesondere betrachten wir hierbei die Viruslast, zelluläre Immunerkennungsmechnismen und die Wirksamkeit von antiviralen Medikamenten. Diese Untersuchungen können helfen, Risiken einer zugrundeliegenden chronischen Hepatitis C während Arenavirus Ausbrüchen abzuschätzen.

Diese Arbeiten werden durch die Deutsche Leberstiftung gefördert (S1 63/10135/2017)

Kooperationspartner: Stefan Kunz (CHUV, Lausanne, Schweiz), Jan Münch (Universität Ulm)

Charakterisierung von CD81 Rezeptor-Interaktionen bei der Hepatozyten Invasion von Hepatitis C Virus und Plasmodium

Bruening J, Banse P, Kahl S, Vondran FW, Kaderali L, Marinach C, Silvie O, Pietschmann T, Meissner F*, Gerold G* (2018)  Hepatitis C virus enters liver cells using the CD81 receptor complex proteins calpain-5 and CBLB. Manuscript accepted for publication at PLOS Pathogens. *these authors contributed equally

Lasswitz L, Chandra N, Arnberg N*, Gerold G* (2018)  Glycomics and proteomics approaches to investigate early adenovirus - host cell interactions. J Mol Biol. doi: 10.1016/j.jmb.2018.04.039. *these authors contributed equally

Banse P, Bruening J, Lasswitz L, Kahl S, Khan AG, Marcotrigiano J, Pietschmann T, Gerold G (2018) CD81 receptor regions outside the large extracellular loop determine hepatitis C virus susceptibility. Viruses doi: 10.3390/v10040207.

Gerold G, Bruening J, Weigel B, Pietschmann T (2017) Protein interactions during the flavivirus and hepacivirus life cycle. Mol Cell Proteomics. pii: mcp.R116.065649.

Gerold G, Meissner F, Bruening J, Welsch K, Perin PM, Thomas F. Baumert, Vondran FW, Kaderali L, Marcotrigiano J, Khan AG, Mann M, Rice CM, Pietschmann T (2015) Quantitative Proteomics Identifies Serum Response Factor Binding Protein 1 as a Host Factor for Hepatitis C Virus Entry. Cell Reports. 4;12(5):864-78.

Funding:  DFG (GE  2145/3-1), DFG (GE  2145/3-2), DFG (SFB900-C7), DZIF (TI 07.003), Deutsche Leberstiftung (S163/10073/2011), HFSPO (LT000048/2009-L).

Identifizierung von Eintrittsfaktoren Moskito-übertragbarer und gastrointestinaler Viren

Fedeli C, Torriani G, Galan-Navarro C, Moraz ML, Moreno H, Gerold G, Kunz S (2018) Axl Can Serve as Entry Factor for Lassa Virus Depending on the Functional Glycosylation of Dystroglycan. J Virol. doi: 10.1128/JVI.01613-17.

von Schaewen M, Dorner M, Hueging K, Foquet L, Gerges S, Hrebikova G, Heller B, Bitzegeio J, Doerrbecker J, Horwitz J, Gerold G, Suerbaum S, Rice CM, Meuleman P, and Pietschmann T, Ploss A (2016) Expanding the host range of hepatitis C virus through viral adaptation. MBio. 8;7(6).

Scull MA, Shi C, de Jong YP, Gerold G, Ries M, von Schaewen M, Donovan BM, Labitt RN, Horwitz JA, Gaska JM, Hrebikova G, Xiao JW, Flatley B, Fung C, Chiriboga L, Walker CM, Evans DT, Rice CM, Ploss A. (2015) Hepatitis C virus infects rhesus macaque hepatocytes and simianized mice. Hepatology. 62(1):57-67.

Gerold G, Bruening J, Pietschmann T. (2015) Decoding protein networks during virus entry by quantitative proteomics. Virus Research. 218:25-39.

Kapoor A, Simmonds P, Gerold G, Qaisar N, Jain K, Henriquez JA, Firth C, Hirschberg DL, Rice CM, Shields S, Lipkin WI. (2011) Characterization of a canine homolog of hepatitis C virus. PNAS. 108(28):11608-13.

Funding:  DFG (GE  2145/3-2), German Liver Foundation (S163/10135/2017), DAAD, ZIB, Friends of the MHH.