Projekte Molekulare Bakteriologie

Identifizierung neuer Biofilm-aktiver /-auflösender Substanzen

Durch bakterielle Biofilme hervorgerufene chronische Infektionen sind bis heute nicht effektiv therapierbar. Der Grund: Die Bakterien sind innerhalb des Biofilms erfolgreich gegen das Immunsystem und die Antibiotika-Therapie geschützt. Um dieses Problem zu bekämpfen, suchen die Wissenschaftler in einem vom BMBF geförderten Projekt gemeinsam mit Partnern aus akademischer Forschung (Helmholtz-Zentrum für Infektionsforschung in Braunschweig (HZI), Helmholtz-Institut für Pharmazeutische Forschung in Saarbrücken (HIPS), Leibniz Universität Hannover (LUH) und Fraunhofer Institut für Toxikologie und Experimentelle Medizin (ITEM)) und Industrie (Sanofi Aventis GmbH) nach neuen Biofilm-aktiven bzw. Biofilm-auflösenden Wirkstoffen, die innerhalb von 3 Jahren bis zur präklinischen Phase weiterentwickelt werden sollen. Dazu werden zehntausende Substanzen getestet, die aus Naturstoffbibliotheken und Kulturextrakten der beteiligten Partner stammen. Das Hauptaugenmerk liegt dabei auf der Aktivität gegenüber Biofilmen von Pseudomonas aeruginosa und Staphylokokkus aureus, da diese pathogenen Keime für einen Großteil chronischer Infektionen verantwortlich sind.

Abbildung 1: Klinisches Isolat von P. aeruginosa, behandelt mit unterschiedlichen Verbindungen, die die Biofilm-Struktur und Viabilität beeinflussen (grün/rot = lebend/tot)

Abbildung 2: Entwicklung eines neuartigen mikroskopischen Verfahrens für schnelle quantitative & qualitative Biofilm-Untersuchungen

Die Projektgruppe führt die visuelle Charakterisierung von bakteriellen Biofilmen in Mikrotiterplatten mittels automatisierter konfokaler Mikroskopie durch. Diese Schlüsseltechnologie ermöglicht einen High Content Screen der zu testenden Substanzen und somit eine parallele Aussage über die Struktur und Viabilität von vielen Biofilmproben. Dadurch können schnell und zuverlässig potenzielle Wirkstoffkandidaten identifiziert werden, die innerhalb des Konsortiums weiterentwickelt werden.

Die in der Projektgruppe etablierte Methode der automatisierten konfokalen Mikroskopie soll außerdem für einen weiteren High Content Screen verwendet werden. In dieser Studie wollen wir zeigen, dass die am TWINCORE ermittelten Resistenzprofile von Biofilmen klinischer Pseudomonas-Isolate von Mukoviszidose-Patienten ein verlässlicheres Werkzeug für die Kliniker darstellen als bisherige Bestimmungen von planktonischen Bakterien. Letztere spiegeln die in vivo-Situation nur schlecht wider und weichen erheblich von den Ergebnissen der Biofilm-Suszeptibilitätstestung ab.  Durch die Annäherung an in vivo-Bedingungen im Testsystem lässt sich hoffentlich die Wirksamkeit der eingesetzten Antibiotikatherapien maximieren.

Adaptionsprozess von Pseudomonas aeruginosa

Abbildung 3: wt nach 4 Stunden mit Antibiotika
Abbildung 4: wt nach 24 Stunden mit Antibiotika

Biofilme stellen die dominante und ubiquitär verbreitete Lebensform dar, welche Mikroorganismen dazu befähigt, einer Vielzahl von Stressfaktoren zu widerstehen und  ihnen - damit einhergehend - die Besiedlung unterschiedlichster Grenzflächen ermöglicht. Besonders die erhöhte Antibiotika-Resistenz der Biofilme pathogener Erreger, wie Pseudomonas aeruginosa, stellt ein schwerwiegendes klinisches Problem dar.

Die Etablierung eines Biofilms beginnt mit einer - zunächst noch transienten - Anheftung einzelner Zellen an eine Oberfläche. Dieser Adhäsionsprozess führt zu einer metabolischen Umstellung der Zellen und bildet die Basis für ein dauerhaft sesshaftes Leben der Zellen. Im Rahmen dieses Forschungsschwerpunktes wollen wir essenzielle Faktoren und zentrale zelluläre Prozesse identifizieren, die eine solche Anheftung von P. aeruginosa an eine Oberfläche determinieren. Dies führt nicht nur zu einem besseren Verständnis der inter- und intrazellulären Prozesse der initialen Anheftung von Bakterien an Oberflächen. Es kann insbesondere auch mögliche Angriffspunkte entlarven, die ein Eingreifen in die Adhäsionsprozesse und damit auch in die frühe Entwicklung des gesamten Biofilmaufbaus ermöglichen. Diese Identifizierung der kleinstmöglichen Gruppe essenzieller Faktoren für die Adhäsion von Pseudomonas-Zellen an eine Oberfläche ist der erste Schritt in Richtung klinischer Prävention der Biofilmbildung.

Des Weiteren wird innerhalb des Schwerpunktes ein besonderer Fokus auf die Untersuchung von Resistenzmechanismen adhärierter Zellen gelegt, was den weitestgehend unbekannten Adaptationsmechanismen des sessilen - gegenüber des planktonischen - Lebensstils weitere wichtige Aspekte hinzufügen kann.

In vivo Biofilm Modellsysteme

Ihre Fähigkeit, innerhalb von Biofilmen zu wachsen, ist entscheidend für die Pathogenese chronischer Infektionen. Das Wachstum in Biofilmen schützt die Bakterien nicht nur vor dem Immunsystem sondern auch vor antimikrobiellen Wirkstoffen. Es existieren einige Analysesysteme, die bereits bei der Entwicklung neuer therapeutischer Strategien behilflich sind - etwa für kombinierte antimikrobielle Behandlungen. Das Manko dieser Systeme besteht darin, dass sie auf in vitro Experimenten basieren. Um solche Therapien in die klinische Praxis zu überführen, sind passende Tiermodelle unabdingbar. In Kooperation mit der Forschungsgruppe Molekulare Immunologie des HZI wird ein Mausmodell entwickelt, bei dem sich intravenös injizierte Pseudomonas aeruginosa Bakterien in transplantierbaren subkutanen Tumoren anreichern.

Elektronenmikroskopische Aufnahmen deuten darauf hin, dass diese Bakterien im Tumorgewebe in Biofilmstrukturen leben. Auch die Immunhistologie zeigt, dass eine Infektion des Tumorgewebes eine Immunantwort auslöst, die durch starkes Einströmen von Neutrophilen Granulozyten charakterisiert ist. Das Modell ist experimentell steuerbar und es könnte der systematischen Evaluierung der Rolle diverser bakterieller Faktoren bei der Bildung bakterieller Biofilminfektionen in vivo dienen. Zudem erlaubt es die Bewertung der Effizienz verschiedener neuer therapeutischer Strategien zur Kontrolle von Biofilmen.

Abbildung 5: Manfred Rhode (HZI) Transmissions-Elektronenmikroskopie eines durch Preudomonas aeruginosa besiedelten CT26 Tumors. Beobachtet wird Bakterienwachsstum in Clustern.