Projekte Experimentelle Infektionsforschung

Virale Pathogenese

Bei viralen Infektionen spielen insbesondere frühe Typ I Interferon-Antworten eine kritische Rolle. In früheren Projekten haben wir gefunden, dass nach einer Infektion mit dem vesikulären Stomatitis Virus (VSV) eine kleine Anzahl hoch spezialisierter Zellen, die auch als plasmazytoide dendritische Zellen (pDC) bezeichnet werden, über das Binden von Pathogen-Erkennungsrezeptoren (PRR) aktiviert werden, um große Mengen an schützendem Typ I Interferon zu produzieren. Interessanterweise haben alle genauer untersuchten Viren Gegenmaßnahmen zur Hemmung der Induktion oder der Funktion von Typ I Interferon entwickelt. Ein Schwerpunkt unserer Arbeit besteht darin herauszufinden, wie unterschiedliche Viren Typ I Interferon-Antworten induzieren und welche Strategien sie entwickelt haben, Typ I Interferon-Antworten zu unterwandern. Die lokalen Verhältnisse von Typ I Interferon-Antworten beeinflussen entscheidend den Krankheitsverlauf. Wir untersuchen, in welchen Organen Typ I Interferon-Antworten induziert werden und welche Zelltypen vom Typ I Interferon aktiviert werden müssen, damit Schutz vermittelt wird. Dabei spielt die Untersuchung von Mechanismen, die die Ausbreitung von viralen Erregern im Zentralnervensystem hemmen, eine wichtige Rolle. Wir untersuchen, welchen Einfluss frühe Typ I Interferon-Antworten auf die Induktion adaptiver Immunantworten haben. Neben innovativen Mausmodellen mit einer konditionellen Typ I Interferon-Rezeptor Deletion oder einem rekonstituierbarem Typ II IFN Gen kommen Mäuse zum Einsatz, bei denen gleich mehrere PRR Plattformen deletiert sind. Weiterhin werden Experimente mit primären humanen Immunzellen durchgeführt.

Interferonantworten zur Abwehr von Virusinfektionen

Plasmazytoide dendritische Zellen (pDC) sind nach Virusinfektionen wichtige Typ I Interferon Produzenten. Zahlreiche Studien haben Mustererkennungsrezeptoren beschrieben, die in unterschiedlichen Zelltypen für die Erkennung von Erregern und die nachfolgende Induktion von Interferonantworten eine Rolle spielen. Dabei ist es bisher unklar gewesen, ob pDC direkt infiziert werden müssen, um zur Typ I Interferonproduktion angeregt zu werden. Auch war nicht bekannt, welchen Einfluss die Interferonproduktion dieser Zellen auf die Pathogenese von viralen Infektionen hat. Je nach Art und Verteilung eines Erregers können lokale Interferonantworten einen massiven Einfluss sowohl auf Immunzellen wie auch das infizierte Gewebe und auch auf die Vermehrung des Erregers selbst haben. Mit neueren Arbeiten konnten wir zur Klärung dieser wichtigen Fragen mit Studien von murinen und humanen Modellen beitragen.

Infizierte Zellen regen pDC stärker zur Interferonproduktion an als freies Virus
Die in vitro Stimulation von pDC mit dem Vesikulären Stomatitis Virus (VSV) führt zur Induktion von starken Typ I Interferon Antworten. Anders als pDC sind konventionelle myeloide dendritische Zellen (mDC) nach VSV Stimulation eher schwache Typ I Interferon Produzenten. Die Induktion von Typ I Interferon in pDC ist dabei von der Virus-Erkennung durch den Toll-ähnlichen Rezeptor 7 (TLR-7) abhängig, wohingegen mDC VSV-Infektionen via RIG-I-ähnliche Helikasen wahrnehmen. Interessanterweise zeigten pDC jedoch im Gegensatz zu mDC eine beachtliche Resistenz gegen eine direkte VSV-Infektion. Lediglich ein kleiner Teil von pDC (unter 10%) exprimierte nach Infektion mit einer eGFP-kodierenden VSV Variante (VSVeGFP) eine grüne Fluoreszenz, die auf eine direkte Infektion schließen ließ. Dagegen waren mDC Kulturen nach Inkubation mit der gleichen VSVeGFP Dosis nahezu vollständig infiziert. Um zu testen, ob diejenigen Zellen, die direkt infiziert sind auch gleichzeitig Typ I Interferon exprimieren, wurden Reporter-Mäuse (MOB – marker of interferon-β) verwendet, welche abhängig von IFN-β auch ein gelb-fluoreszierendes Reporterprotein (YFP) exprimieren. Die Stimulation von MOB pDC mit VSVeGFP zeigte jeweils eine GFP+ und YFP+ Subpopulation, während keine doppelpositiven GFP+YFP+ pDC gefunden wurden (Abb. 1A). Dieses Ergebnis verdeutlichte, dass unter den pDC die infizierten Zellen kein Interferon-β exprimierten, und dass stattdessen die nichtinfizierten Zellen wichtige Produzenten waren. Im Gegensatz dazu waren alle YFP+ Interferon-β produzierenden mDC gleichzeitig GFP+, also VSVeGFP-infiziert (Abb. 1B). Somit exprimierten mDC Interferon-β als Antwort auf eine direkte Infektion (Frenz et al., 2014). Diese Daten legen nahe, dass pDC nicht durch direkte Infektion sondern vielmehr durch stimulierende Faktoren anderer infizierter Zellen zur Typ I Interferon Produktion angeregt werden. Tatsächlich produzierten pDC nach Stimulation mit infizierten mDC signifikant höhere Mengen an Typ I Interferon als nach Stimulation mit freiem Virus (Abb. 1C).

Abbildung 1: Nach VSV Behandlung exprimieren hauptsächlich nicht-infizierte pDC und infizierte mDC Interferon-β. (A) Anders als pDC benötigen mDC eine direkte Virus-Infektion, um Typ I Interferonantworten zu induzieren. Während eine Interferon-β Expression (YFP+) ausschließlich in GFP- nicht-infizierten MOB Reporter pDC gefunden wurde, waren alle YFP+ Interferon-β-produzierenden mDC auch infiziert (GFP+). (B) Schematische Darstellung der Befunde in (A). (C) VSV-infizierte mDC (mDCinf) induzieren in pDC signifikant stärkere Interferon-α Antworten als freies VSV (weitere Details in Frenz et al., 2014).

Das Zytomegalievirus wendet verschiedene Strategien an, um die Induktion von antiviralen Interferonantworten zu inhibieren
Bei gesunden Personen unterbindet das funktionelle Immunsystem die Vermehrung und Ausbreitung des humanen Zytomegalievirus (HCMV), wobei in der Regel das Virus latent in Zellen des Wirts vorhanden bleibt. Werden immunsupprimierte Patienten infiziert oder findet eine Reaktivierung des latenten Virus statt, so kann das dramatische Folgen für den Patienten haben. Murines CMV (MCMV) ist ein gut etabliertes Modell für die Analyse des empfindlichen Wirt/Erreger-Gleichgewichts. Die immunologische Kontrolle von MCMV Infektionen hängt von der frühen Induktion von Typ I Interferonantworten ab. Bisher war unklar, ob MCMV-kodierte Evasine die Induktion von Interferonantworten hemmen. Wir konnten eine verstärkte Expression von frühen MCMV-Genen in aus Knochenmarkszellen differenzierten Makrophagen (MΦ) und mDC nachweisen, während in pDC keine MCMV-Genexpression nachweisbar war. Jedoch zeigten MCMV stimulierte pDC stärkere Typ I Interferonantworten als MΦ oder mDC. Die Interferoninduktion in pDC ist dabei von der Virus-Erkennung durch den Toll-ähnlichen Rezeptor 9 (TLR-9) abhängig, wohingegen mDC und MΦ MCMV-Infektionen unabhängig von TLR und RIG-I-ähnlichen Helikasen erkennen. Experimente mit der MCMV Variante MCMV-ΔM27, welcher der STAT2 Antagonist M27 fehlt, zeigten in mDC und MΦ eine stärkere Interferoninduktion im Vergleich zur Stimulation mit wildtyp MCMV. Im Gegensatz dazu exprimierten pDC gleiche Mengen von Typ I Interferon nach Stimulation mit MCMV-ΔM27 und wildtyp MCMV (Döring et al., 2014). Diese Experimente veranschaulichen, dass das virale Evasin M27 nicht nur Typ I Interferonrezeptor vermittelte Signale hemmt, sondern auch die Induktion von Interferonantworten in mDC und MΦ. Zusammengenommen sind dies die ersten Ergebnisse, die zeigen, dass MCMV spezifische Mechanismen entwickelt hat, um Typ I Interferonantworten in unterschiedlichen Immunzellentypen zu modulieren.

Abbildung 3: Schematische Zusammenfassung der Rolle des MCMV kodierten Evasins M27 bei der Infektion von Immunzellen (weitere Details in Döring et al., 2014).

Nicht nur pDC, sondern auch Stromazellen müssen nach einer viralen Infektion Erreger erkennen, damit sich ein langfristiger Immunschutz entwickelt
Obwohl pDC nach einer Virusinfektion wichtige Typ I Interferonproduzenten sind, legen neuere Daten nahe, dass die Depletion von pDC keinen entscheidenden Einfluss auf den Verlauf von Virusinfektionen hat. Um die biologische Bedeutung von pDC zu klären, wurden gentechnisch veränderte Mäuse hergestellt, bei denen die für die VSV Erkennung relevanten Erkennungsrezeptoren deletiert sind. Dabei fehlen diesen Tieren die Adaptorproteine MyD88 und TRIF für die Viruserkennung über Toll-ähnliche Rezeptoren, sowie der Adaptor Cardif, der auch als IPS-1 bezeichnet wird, für die Erkennung über zytosolische RIG-I ähnliche Helikasen (MyTrCa-/-). Tatsächlich können solche MyTrCa-/- Mäuse nach einer VSV Infektion kein schützendes Typ I Interferon produzieren (Abb. 4A) und versterben innerhalb weniger Tage. Werden jedoch wildtyp pDC, welche über ein intaktes Viruserkennungssystem verfügen, in MyTrCa-/- Mäuse adoptiv transferiert, überleben so behandelte Tiere VSV Infektionen bis zu 8 Tage länger (Spanier et al., 2014). Bei näherer Betrachtung kann man feststellen, dass die Interferon-β Antwort von adoptiv transferierten pDC in MyTrCa-/- und Kontroll-Tieren dem Muster einer natürlichen Interferoninduktion in sekundären lymphatischen Organen von wildtyp Tieren entspricht (vergleiche Abb. 4A, obere Reihe, und Abb. 4B). Diese Daten belegen, dass nach Stimulation adoptiv transferierte pDC in sekundäre lymphatische Organe rekrutiert werden. Die Analyse von knochenmarkschimären Mäusen, bei denen entweder nur die Immunzellen oder die sonstigen radioresistenten Körperzellen aus MyTrCa-/- Mäusen stammen, zeigte, dass neben den pDC auch andere Körperzellen einen entscheidenden Beitrag leisten, VSV zu erkennen und eine schützende Immunantwort einzuleiten. Neueste Experimente belegen, dass Stromazellen in sekundären lymphatischen Organen zur Interferonproduktion beitragen. Derzeit untersuchen wir, welche Stromazelltypen an der Viruserkennung beteiligt sind und die Induktion einer schützenden Immunantwort unterstützen.

Abbildung 4: In Folge einer VSV Infektion wird TLR- und RLH-abhängig in sekundären lymphatischen Organen eine schützende Typ I Interferonantwort induziert. (A) 24 und 48 nach i.v. VSV Infektion wurde in immunkompetenten Interferon-β Reportertieren eine starke Interferon-β abhängige Luziferase Expression in sekundären lymphatischen Organen beobachtet, während Mustererkennungsrezeptor-defiziente MyTrCa-/- Interferon-β Reportermäuse keine Interferon-β Expression zeigten. (B) Adoptiv transferierte Interferon-β-Reporter pDC zeigten eine vergleichbar lokalisierte Interferon-β Induktion in wildtyp und MyTrCa-/- Mäusen (weitere Details Spanier et al. 2014).

Virale Hepatitis

Nicht die Infektiosität einzelner Viruspartikel, sondern deren effektive Bildung ist für die Hepatitis C Virus-vermittelte Induktion von Interferonantworten in humanen pDC relevant
Weltweit sind etwa 160 Millionen Menschen mit dem Hepatitis C Virus (HCV) infiziert. Wichtige Kennzeichen von HCV sind dessen genetische Variabilität und die sehr unterschiedlichen Krankheitsverläufe infizierter Patienten. Deshalb haben wir untersucht, ob Virusvarianten eines Genotyps unterschiedlich starke Antworten des angeborenen Immunsystems induzieren. Dafür haben wir humane pDC aus dem Blut gesunder Spender isoliert und mit zwei verschiedenen, in Zellkultur angezogenen Genotyp 2a HCV Varianten stimuliert (Abb. 2A). Das Patientenisolat JFH1 induzierte keine Interferon-α Antworten, während das chimäre Jc1 Virus starke Interferon-α Antworten induzierte (Abb. 2B). Wurde dagegen in den Stimulationsexperimenten partiell gereinigtes Jc1 eingesetzt, wurden keine Interferon-α Antworten induziert. In Kokulturen von pDC mit infizierten Hepatomzellen konnten sowohl JFH1 als auch Jc1 infizierte Zellen Interferon-α Antworten in pDC induzieren, jedoch waren auch hier die Antworten gegen das Jc1 Virus deutlich stärker, als die gegen das JFH1 Virus. Nachdem sich herausstelle, dass nicht die Infektiosität der Viruspartikel entscheidend für die Stimulation war, untersuchten wir als nächstes den Einfluss der Effektivität der Viruspartikelbildung. Mittels Jc1 Mutanten, bei denen an unterschiedlichen Schritten die Viruspartikelbildung inhibiert ist, konnten wir zeigen, dass eine effiziente Viruspartikelbildung für die Induktion von Interferon-α Antworten in pDC entscheidend ist (Grabski et al., 2014). Diese Untersuchung zeigt somit erstmals auf, dass die genetische Variabilität von HCV zu einer unterschiedlich starken Induktion der angeborenen Immunität führen kann. Derzeit wird mit klinischen Proben untersucht, ob im Fall von HCV Varianten, die schlechtere Antworten der angeborenen Immunität induzieren, insgesamt schwerere Krankheitsverläufe zu beobachten sind.

Abbildung 2: Anders als die HCV Variante JFH1 induziert die Variante Jc1 Interferon-α Antworten in primären humanen pDC. (A) Schematische Darstellung des JFH1 Virus und der Viruschimären Jc1, die beide dem Genotyp 2a zugerechnet werden und sich nur in den Strukturgenen unterscheiden. (B) pDC wurden mit Viruspartikeln in einen Verhältnis von einem Viruspartikel pro Zelle (MOI 1) stimuliert und nach 18 Stunden Inkubation wurde der Interferon-α Gehalt in zellfreien Kulturüberstände mittels ELISA bestimmt (siehe auch Grabski et al., 2015).

Virale Enzephalitis

Bei einer viralen Enzephalitis produzieren nicht pDC, sondern im Hirn lokalisierte Astrozyten protektives Interferon
Da es sich bei Neuronen um eine essentielle, und in weiten Teilen nicht-erneuerbare Zellpopulation handelt, werden im zentralen Nervensystem (ZNS) ganz besondere Anforderungen an die anti-virale Immunantwort gestellt. So existiert im ZNS ein Milieu, das als „immunprivilegiert“ bezeichnet wird und in dem notwendige Immunantworten so moduliert sind, dass die Beeinträchtigung und der Verlust von Neuronen möglichst gering sind. Eine wichtige Rolle bei der Abwehr von viralen Infektionen des ZNS spielen die Typ I Interferone. Bereits in früheren Studien konnten wir zeigen, dass eine Typ I Interferon-abhängige Signalweiterleitung innerhalb des Gehirns notwendig ist, um nach einer VSV Infektion das Überleben zu sichern. Da sich im Hirn sind jedoch keine pDCs finden, müssten diese erst nach einer Infektion einwandern. Das würde zu lange dauern, um eine adäquate Immunantwort zu vermitteln. Zudem verhindert die Blut-Hirn-Schranke, dass Typ I Interferon aus dem Blut in das Hirn übertritt. So stellte sich die Frage, welche Zellen im ZNS bei einer Virusinfektion schützendes Typ I Interferon bilden? Wir konnten zeigen, dass nach einer intranasalen VSV Infektion das Virus in das Riechhirn gelangt und dort von Astrozyten vermittelte Typ I Interferonantworten induziert (Abb. 5). Hierbei wird in erster Linie Interferon-β gebildet, wohingegen die Interferon-α Subtypen im ZNS nur eine untergeordnete Rolle spielen (Detje et al., 2015). Bei Astrozyten handelt es sich um Gliazellen, die unter anderem am Aufbau der Blut-Hirn-Schranke beteiligt sind. Sie stehen in direktem Kontakt mit Neuronen und übernehmen deren Versorgung mit Neurotransmittern und Nährstoffen. Offensichtlich übernehmen sie darüber hinaus eine wichtige immunologische Funktion und modulieren über die lokale Typ I Interferonproduktion das Immungeschehen im ZNS.

Abbildung 5: Nach intranasaler VSV Applikation kommt es im Riechhirn des zentralen Nervensystems zu einer lokalen Induktion von Interferon-β. (A) Drei Tage nach intranasaler VSV Infektion zeigen IFN-β Reportermäuse im vorderen Bereich des Schädels eine massive Induktion der Interferon-β-Promotor abhängigen Luziferase, deren Expression proportional von der IFN-β Expression abhängt und im In vivo Imager dargestellt ist. (B) Eine ex vivo Analyse zeigt, dass nach einer intranasalen VSV Infektion das schützende Interferon-β lokal im Riechhirn gebildet wird, wohingegen im Großhirn, Kleinhirn und Hirnstamm keine Interferon-β-Promoter Aktivität detektierbar ist (siehe auch Detje et al., 2015).

Neue Strategien zur Prävention und Behandlung von Infektionserkrankungen

In den letzten Jahren sind im Bereich der biologischen Arzneimittel dramatische Durchbrüche gelungen. Viele verschiedene monoklonale Antikörper werden in der Therapie unterschiedlichster Erkrankungen eingesetzt und derzeit befinden sich dutzende neuer Reagenzien in der Entwicklung. Wir untersuchen, wie die konstanten Antikörperanteile über Fc-Rezeptoren mit anderen Zellen interagieren und welchen Einfluss derartige Interaktionen auf die Funktion von therapeutischen Antikörpern haben. Im Fokus stehen derzeit monoklonale Antikörper, die gegen Oberflächenantigene von T-Zellen gerichtet sind. Für diese Untersuchungen entwickeln wir neue Testsysteme, die auf vorbehandelten Immunzellen des menschlichen Bluts oder auf Immunzellen aus sekundären lymphatischen Organen, wie zum Beispiel den Tonsillen, basieren. Eine weitere wichtige Gruppe von biologischen Arzneimitteln sind Impfstoffe. Insbesondere durch die Entwicklung neuer Adjuvanzien zeichnen sich vielversprechende Optionen ab. Wir untersuchen die Eigenschaften von RNA-basierten Adjuvanzien. Einen weiteren Fokus stellen neuen Formulierungen dar. Wir untersuchen Verkapselungsmethoden, die eine selektive Beladung von humanen Antigen-präsentierenden Zellen mit aktiven Substanzen erlauben. Um die Ergebnisse aus den oben beschriebenen Ansätzen noch besser bei der Beantragung und Durchführung klinischer Prüfungen anzuwenden, werden gemeinsam mit der Danish Medicines Agency Untersuchungen im Bereich der regulatorischen Forschung durchgeführt.